Development of a functionalized hydrogel as cell recruiting biomaterial for tissue-engineering

Abstract

Chronic coronary syndrome often requires the surgical replacement of coronary arteries. It is a worldwide hope to develop small-diameter vascular grafts that can replace autologous vessels use in clinics. The development of a functional biocompatible coating to avoid thrombogenesis and promote endothelialization is essential to the development of small diameter vascular grafts. We propose here to combine the properties of type I collagen, the main protein forming the vascular extracellular matrix with weak antigenicity and heparins, used as anticoagulant in clinics, to achieve this goal. Therefore, low molecular weight heparin and unfractionated heparin at three different concentrations (1, 6 or 10 UI/mL) were added to collagen-based hydrogels formed by pH-driven self-assembly. These heparinized collagen-based hydrogels were evaluated for their physicochemical properties (gelation kinetic, swelling, spreading, viscoelastic properties, stability and heparin loading), their biocompatibility (albumin adsorption, endothelial cells growth) and their capacity to release active heparins with antithrombotic properties (standard clotting times, thrombin generation test). The heparinization of collagen-based hydrogels did not influence their gelation kinetic formation, swelling, or stability in human albumin solution. However, hydrogel spreading on a collagen coated surface was facilitated by the increase in both type of heparin loading attested by a decrease in contact angle and hydrogel height. The specific heparin content was directly quantified using FITC-labeled heparins showing that heparin loading in collagen-based hydrogels increased along the initial concentration of both heparins types used to prepare the gels. Although collagen-based hydrogel prepared with 10 UI/mL had the highest heparin content, its incorporation ratio of 25% for LH10 and 44% for UH10 was identical to the one of collagen-based hydrogel prepared with 6 UI/mL. Therefore, the study of viscoelastic properties of hydrogel was continued with collagen-based hydrogels prepared with 1 and 6 UI/mL. The highest heparin concentration resulted in the formation of a softer hydrogel. Moreover, heparin released from collagen-based hydrogels during three hours delayed blood coagulation (activated partial thromboplastin time and thrombin time) and decreased or abolished thrombin generation in the presence of platelets, with low albumin adsorption and no impact on cell viability compared with non-heparinized collagen-based hydrogel. Moreover, collagen-based hydrogel had the potential to retain heparin for at least seven days of culture with endothelial cell, providing the possibility of long-term antithrombotic properties. Finally, the functionalization of collagen-based hydrogel prepared with 6 UI/mL of both heparins was achieved with monocyte chemoattractant protein-1. Its loading was enhanced when collagen-based hydrogels were heparinized with unfractionated heparin.

Keywords: collagen hydrogel; low molecular weight heparin; unfractionated heparin; hydrogel; tissue engineering; graft coating, antithrombotic properties; monocyte chemoattractant protein-1

Résumé
Le syndrome coronarien chronique nécessite souvent le remplacement chirurgical des artères coronaires. Des grands espoirs sont tournés vers le développement de greffons vasculaires de petit diamètre pouvant se substituer aux vaisseaux autologues utilisés en clinique. Ces greffons de petit diamètre devront présenter un revêtement luminal biocompatible et fonctionnel pour éviter la thrombogénèse et promouvoir l'endothélialisation. Afin d’atteindre cet objectif, nous proposons ici de combiner les propriétés du collagène de type I, principale protéine formant la matrice extracellulaire vasculaire et faiblement antigénique, à celles des héparines, utilisées comme anticoagulant en clinique. Par conséquent, trois concentrations différentes (1, 6 ou 10 UI/mL) d'héparine de faible poids moléculaire ou d'héparine non fractionnée ont été ajoutées à des hydrogels formés par auto-assemblage (variation de pH) de collagène de type I. Ces hydrogels de collagène héparinés ont été évalués pour leurs propriétés physicochimiques (cinétique de gélification, gonflement, étalement, propriétés viscoélastiques, stabilité et charge en héparine), leur biocompatibilité (adsorption d'albumine, croissance des cellules endothéliales) et leur capacité à libérer des héparines actives présentant des propriétés antithrombotiques (temps de coagulation standard, test de génération de thrombine). L'héparinisation des hydrogels de collagène n'a pas influencé leur formation cinétique de gélification, leur gonflement ou leur stabilité dans une solution d'albumine humaine. Cependant, l'étalement de l'hydrogel sur une surface recouverte de collagène a été facilité par l'augmentation de la concentration des deux types d’héparine, en attestent par une diminution de l'angle de contact et de la hauteur de l'hydrogel. La quantité d’héparine incorporée dans les hydrogels de collagène a été directement quantifiée à l'aide d'héparines marquées au FITC montrant une augmentation de l’incorporation d’héparine dans les hydrogels de collagène fonction de la concentration initiale des deux types d'héparine utilisées pour préparer les gels. Bien que l'hydrogel de collagène préparé avec 10 UI/mL ait la teneur en héparine la plus élevée, son taux d'incorporation de 25% and 44% était identique à celui de l'hydrogel de collagène préparé avec 6 UI/mL d’héparine. Par conséquent, l'étude des propriétés viscoélastiques de l'hydrogel a été poursuivie avec des hydrogels de collagène préparés avec 1 et 6 UI/mL. La concentration d'héparine la plus élevée a entraîné la formation d'un hydrogel plus souple. De plus, l'héparine libérée des par les hydrogels de collagène pendant trois heures a retardé la coagulation sanguine (temps de thromboplastine partielle activée et temps de thrombine) et a diminué ou aboli la génération de thrombine en présence de plaquettes, avec une faible adsorption d'albumine et sans impact sur la viabilité cellulaire par rapport à l'hydrogel de collagène non hépariné. De plus, l'hydrogel de collagène a montré un potentiel de rétention de l'héparine pendant au moins sept jours de culture avec des cellules endothéliales, ce qui permettait d'envisager des propriétés antithrombotiques à long terme. Enfin, la fonctionnalisation avec la protéine chimioattractante monocytaire-1 de l'hydrogel de collagène préparé avec 6 UI/mL de l’un ou l’autre des deux types d’héparines a été réalisée avec succès. La charge de MCP-1 est la plus élevée lorsque l’hydrogel de collagène est hépariné avec de l'héparine non fractionnée.

Mots-clés : hydrogel de collagène ; héparine de faible poids moléculaire ; héparine non fractionnée ; ingénierie tissulaire ; recouvrement de greffon ; propriétés antithrombotiques ; protéine chimioattractive des monocytes-1